MDA-MB-435S人乳腺導(dǎo)管癌培養(yǎng)步驟:
a、細(xì)胞傳代:如果未超過(guò)80%匯合度時(shí),將瓶裝的wan全培養(yǎng)液收集至離心管中,留5mlwan全培養(yǎng)基,放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng);如果細(xì)胞密度超80%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),
1)對(duì)于貼壁細(xì)胞,傳代可參考以下方法:
1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺(tái),輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上wan全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細(xì)胞,使之wan全脫落后吸出,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,在1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mLwan全培養(yǎng)基重懸。
4. 將細(xì)胞懸液按1:2的比例進(jìn)行分瓶傳代(兩個(gè)T25瓶),補(bǔ)充新的awn全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶, 放入到37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2、對(duì)于懸浮細(xì)胞,傳代可參考以下方法:
方法一:收集細(xì)胞,1000RPM條件下離心8-10分鐘,棄上清液,補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻,將細(xì)胞懸液按1:2的比例分到新的含8mlwan全培養(yǎng)基的新瓶中。
方法二:可選擇半換液方式,棄半數(shù)培養(yǎng)基后,將剩余細(xì)胞懸起,將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8mlwan全培養(yǎng)基新瓶中。
b、細(xì)胞凍存:
1、細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí),棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細(xì)胞一次;
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細(xì)胞回縮變圓后加入5mlwan全培養(yǎng)液終止消化,再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,1000rpm離心 5min;
3、 棄上清,沉淀細(xì)胞加入1ml的雅吉生物無(wú)血清凍存液(貨號(hào):C7001),混勻后加入凍存管中。
4、 將凍存細(xì)胞直接放入-80℃冰箱即可,如后期要將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中,則需在-80℃冰箱 中存放24小時(shí)以上再轉(zhuǎn)入液氮罐中。
C、細(xì)胞復(fù)蘇:
1、從液氮中取出細(xì)胞凍存管(注意佩戴防護(hù)面具),快速將其置入 37℃水浴中解凍, 直至凍存管中無(wú)結(jié)晶,然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁;
2、將凍存管中的細(xì)胞移至含 5ml wan全培養(yǎng)基的15ml離心管中,1000rpm離心5min;
3、棄上清,沉淀用5mlwan全培養(yǎng)基重懸,接種至T25培養(yǎng)瓶,放于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng); 天,換用新鮮wan全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
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